产品货号：
WH0132
中文名称：
miRNA荧光定量检测试剂盒(染料法)
英文名称：
miRsmart miRNA SYBR qPCR Kit
产品规格：
20μl×125次|20μl×500次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒采用SYBR Green I嵌合荧光法的原理进行miRNA荧光定量检测。本试剂盒中的2×miRNA PreMix是专门为miRNA定量检测而研发的新一代预混形式的荧光定量PCR检测试剂，其中的DNA聚合酶采用的是化学修饰的热启动形式，配合特殊的Buffer体系，使反应特异性更好，灵敏度更高，并能在更广的范围内进行准确定量。
保存：-20℃，有效期一年。
Forward Primer设计原则
人类let-7家族的所有3p miRNA共有10条，彼此之间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。以这10条miRNA mimics为模板，以不同引物，使用本试剂盒分别扩增10条miRNA。结果显示，特异性引物只会扩增特异性模板，非特异性识别率低于5%，表明本试剂盒具有良好的特异性，能够区分单碱基差异的miRNA。
相关搜索：miRNA荧光定量检测试剂盒(染料法)，miRNA荧光定量PCR试剂盒，miRNA荧光PCR试剂盒，miRNA荧光qPCR试剂盒，miRNA荧光定量PCR检测试剂盒，miRNA cDNA荧光定量检测试剂盒，microRNA荧光定量PCR试剂盒，microRNA荧光PCR试剂盒，microRNA荧光qPCR试剂盒，microRNA荧光定量PCR检测试剂盒，microRNA cDNA荧光定量检测试剂盒，miRsmart miRNA SYBR qPCR Kit
- 灵敏度高：可在pg级的总RNA中检测到目的miRNA。
- 特异性强：体系全新升级，更好的区分单碱基的差异，完美区分家族中的不同miRNA。
- 通用性好：适用于各种类型的荧光定量PCR仪。
| 组分 | 20μL×125次 | 20μL×500次 |
| 2×miRNA PreMix | 1.25mL | 4×1.25mL |
| Reverse Primer(10μM) | 55μL | 220μL |
| 50×ROX Reference Dye | 250μL | 1mL |
| RNase-Free ddH2O | 2×1mL | 5×1mL |
保存：-20℃，有效期一年。
Forward Primer设计原则
- 遵循引物设计的最普遍原则。
- 以成熟的miRNA序列为基础，将U替换成T，这是最基础的设计方法。
- 试剂盒中提供的下游引物的Tm值为65℃，设计上游引物的Tm值要尽量保证在65℃左右。
- 若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过低，可以在引物的5'端添加几个碱基(最好为G或C碱基)来调整Tm值，但应避免引入二级结构；
- 若按照原则2的方式直接设计的引物其Tm值过高，可以在引物的5'或3'端去掉几个碱基。
人类let-7家族的所有3p miRNA共有10条，彼此之间相差的碱基很少，甚至只有单碱基的差异。以这10条miRNA mimics为模板，以不同引物，使用本试剂盒分别扩增10条miRNA。结果显示，特异性引物只会扩增特异性模板，非特异性识别率低于5%，表明本试剂盒具有良好的特异性，能够区分单碱基差异的miRNA。
- 本试剂盒从-20℃中取出使用时，将冻存的各个组分融解，然后轻轻颠倒混匀，待溶液完全均一后再行使用。如解冻后的2×miRNA PreMix没有使用，须彻底混匀后再重新冷冻(在解冻过程中盐会出现分层现象，未混匀进行冷冻，盐晶体的析出将会对酶造成损害)。
- 本产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存本品或配制PCR反应液过程中应避免强光照射。
- 反应液的配制和分装中，请一定使用新的(无污染的)枪头等耗材，尽量避免污染。
- 本试剂盒须与miRsmart plus miRNA cDNA第一链合成试剂盒(WH0131)配套使用。
- 室温融化2×miRNA PreMix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer。
- 使用时请将2×miRNA PreMix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。
注：如果试剂没有混匀，其反应性能会有所下降，且不要使用振荡器混匀。 - 将试剂置于冰上，并按表1配制反应体系：
用ABI公司的PRISM7000/7300/7700/7900HT，Step one/Step one plus PCR System需按照表2进行加样。
表1成分 50μL体系 20μL体系 终浓度 2×miRNA PreMix 25μL 10μL 1× Forward Primer(自备) - - 200nM Reverse Primer(10μM) 1μL 0.4μL 200nM miRNA第一链cDNA - - - ddH2O 至50μL 至20μL -
表2成分 50μL体系 20μL体系 终浓度 2×miRNA PreMix 25μL 10μL 1× Forward Primer(自备) - - 200nM Reverse Primer(10μM) 1μL 0.4μL 200nM miRNA第一链cDNA - - - 50×ROX Reference Dye 4μL 1.6μL 5× ddH2O 至50μL 至20μL -
注：miRNA第一链cDNA的加入量不要超过Real-time PCR体积的1/10。高浓度cDNA易导致非特异扩增，可对cDNA适当稀释(10倍或者100倍)。表2中，PreMix中的ROX和额外添加的ROX混合后，终浓度为5×。 - PCR反应程序设置
- 一般情况下，可采用如下述程序进行定量PCR反应：
循环 温度 时间 内容 1× 95℃ 15min 起始模板变性 40～45× 94℃ 20sec PCR循环中模板变性 60℃ 34sec 退火，延伸 熔解曲线分析(Melting/Dissociation Curve Stage) - 如需提高低丰度miRNA的检测特异性和检出率可采用下述程序进行定量PCR反应：
循环 温度 时间 内容 1× 95℃ 15min 起始模板变性 5× 94℃ 20sec 富集低丰度目标miRNA，
无需收集荧光信号63～65℃ 30sec 72℃ 34sec 40～45× 94℃ 20sec PCR循环中模板变性 60℃ 34sec 退火，延伸 熔解曲线分析(Melting/Dissociation Curve Stage)
本试剂盒适用的Real-Time PCR扩增仪:
ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast RealTime
PCR System,Step one/Step one plus PCR System (Applied Biosystems)
OPTICONTM/CFX96 (BIORAD)
Light Cycler480 (Roche)
Smart Cycler System (Cepheid)
Mx3000P/Mx3005P (Stratagene)
Line-Gene (Bioer，杭州博日)
其它各种Real Time PCR扩增仪 - 一般情况下，可采用如下述程序进行定量PCR反应：
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